PCR -test

Maximilian Reindl studerte kjemi og biokjemi ved LMU i München og har vært medlem av -redaksjonen siden desember 2020. Han vil gjøre deg kjent med medisinske, vitenskapelige og helsepolitiske emner for deg for å gjøre dem forståelige og forståelige.

Flere innlegg av Maximilian Reindl Alt -innhold kontrolleres av medisinske journalister.

PCR -tester har blitt en uunnværlig del av moderne medisin og molekylær diagnostikk. Fordi de er så presise, regnes de som "gullstandarden". De kan brukes i en lang rekke bruksområder, fra deteksjon av patogener til screening for arvelige sykdommer - det vil si hvor det er nødvendig for pålitelig å oppdage selv de minste spor av arvelig materiale. Finn ut her hvorfor PCR -testen er så presis, hvor den brukes og hvordan den fungerer i detalj.

Hva er en PCR -test?

En PCR -test er en laboratoriemetode fra molekylærbiologi og medisin. Testen brukes for direkte påvisning - og karakterisering - av genetisk materiale. PCR -metoden anses av eksperter for å være enkel å utføre, universelt anvendelig og robust.

I laboratoriet består en PCR -test av to trinn. I et første trinn reproduseres det eksisterende genetiske materialet ved hjelp av polymerasekjedereaksjonen, eller forkortet PCR. På denne måten kan de minste sporene av DNA undersøkes. Dette er også grunnen til at PCR -tester er så følsomme.

I et annet trinn separeres det genetiske materialet, "sorteres" og karakteriseres dermed i henhold til dets egenskaper. Så den fine strukturen til DNA er bestemt.

Det er mange mulige bruksområder: Leger bruker en PCR -test for å undersøke for eksempel utstryk for koronavirus, bloddonasjoner for HIV eller undersøke nyfødte for mulige arvelige sykdommer. Bakterielle infeksjoner - for eksempel med tuberkulosepatogenet - eller parasittiske infeksjoner (malaria) kan også avklares med PCR.

De hjelper også i rettsmedisin med å dømme lovbrytere basert på deres genetiske fingeravtrykk eller brukes som farskapstester.

Alle disse applikasjonene er oppsummert under begrepet molekylær diagnostikk. PCR finner dermed praktisk anvendelse i forskning, diagnostikk og rettsmedisin langt utover deteksjonen av Sars-CoV-2-patogenet.

(Corona) PCR -test kontra rask PCR -test

Vanligvis finner evalueringen av en PCR -test sted i et spesialisert laboratorium. Det betyr at prøvestoffet blir sendt inn og undersøkt der. Resultatet mottas vanligvis noen dager senere.

Ulike oppstart (GNA Biosolutions, Spindiag) presenterte nylig nye typer mobile testenheter. For dette mottok de også spesielle godkjenninger fra Federal Institute for Drugs and Medical Devices (BfArM). Ved hjelp av disse mobile PCR -testenhetene ville en PCR -test også vært mulig uten et spesialisert laboratorium.

Denne tilnærmingen har et stort potensial, ettersom et pålitelig testresultat kan være tilgjengelig innen få timer direkte på stedet der prøven ble tatt (testsenter).

I hvilken grad slike hurtige PCR -testsystemer vil råde i praksis, kan ennå ikke vurderes. Det er heller ikke kjent hvor raskt testsentrene vil bli levert med disse enhetene på tvers.

I overskuelig fremtid vil det derfor fortsatt bli utført "vanlige" laboratoriebaserte PCR-tester, noe som forårsaker en viss forsinkelse mellom prøvetaking og testresultatet.

Hvor pålitelig er en PCR -test?

PCR er en påvist deteksjonsmetode innen molekylær diagnostikk og medisin. Det regnes som den såkalte gullstandarden med en veldig lav feilrate. Testene er spesielt preget av en veldig høy sensitivitet og spesifisitet.

Følsomhet betyr påliteligheten som en test finner det genetiske materialet som skal påvises med.

Spesifisitet betyr den sikkerhet som testen avgjør at det aktuelle genetiske materialet ikke er tilstede i prøven.

Når fungerer PCR-tester i tilfelle en Sars CoV-2-infeksjon?

Som regel oppdager PCR -testen en korona -infeksjon to til tre dager før og opptil 20 dager etter symptomdebut. Selv med infiserte mennesker som forblir helt symptomfrie, fungerer testen i et kritisk tidsvindu når de kan smitte andre.

I individuelle tilfeller er bevis på dette til og med mulig 60 dager etter at symptomene på sykdommen dukket opp.

Den første dagen etter en korona -infeksjon kan en PCR -test også være negativ, selv om det er en infeksjon. I et slikt tilfelle var det ikke nok virus i halsen på tidspunktet for smøreprøven. Men hvis det er en rimelig mistanke om en infeksjon, utfører leger vanligvis en ny PCR -test de følgende dagene.

mulige feilkilder

Feilraten i DNA -kopieringsprosessen er ubetydelig i praksis. Selv om DNA -polymeraser aldri fungerer som de skal, spiller de neppe en rolle i PCR -testprosessen.

I praksis ligger mulige feilkilder i prøvetakingsprosessen: Det er derfor viktig at utdannet medisinsk personell utfører utstryk. Spytt- og gurgelprøver kan muligens redusere nøyaktigheten, ettersom fortynningseffekter forekommer her.

Hvordan fungerer en PCR -test?

En PCR -test utføres for eksempel av fastlegen eller på spesielle testsentre. Først tar leger eller utdannet helsepersonell et utvalg. Vanligvis tas en vattpinne fra den øvre luftveien for testen. Dette tar vanligvis form av en munn- eller nese- og halspinne.

Gurgling med skylleløsning er også mulig. En blodprøve er atypisk for koronadeteksjon - men utbredt, for eksempel ved screening av nyfødte.

Uavhengig av hvilken type prøve som tas, finnes genetisk materiale på bomullspinnen, i skylleløsningen eller i en dråpe blod. Dette prøvestoffet sendes til et laboratorium, hvor det isoleres og renses.

En PCR -test deles deretter inn i to trinn:

• PCR: I dette trinnet multipliseres mengden av det opprinnelige genetiske materialet.
• Elektroforese: I det andre trinnet blir genom -segmentene "sortert" etter størrelse. På denne måten kan prøven karakteriseres - den fine strukturen til det genetiske materialet bestemmes.

Trinn 1: PCR - "Polymerasekjedereaksjonen"

"PCR" er det første av to arbeidstrinn: Her multipliseres mengden av eksisterende start -DNA. Fordi bare når det genetiske materialet er tilgjengelig i tilstrekkelig mengde, kan det undersøkes. Stort sett er dette menneskelig DNA; tester for koronaviruset er følgelig virus -RNA.

Forkortelsen PCR står for det engelske uttrykket “Polymerase Chain Reaction”.

Hva er nødvendig for en PCR?

Start -DNA er lokalisert i en reaksjonskar med spesielle stoffer. Det eksisterende genetiske materialet fungerer som en mal, som kopieres i nærvær av visse enzymer (Taq -polymerase) og visse grunnleggende DNA -byggeklosser.

Kopieringsprosessen foregår i flere repetitive kjøringer (sykluser).

Nærmere bestemt kombineres følgende stoffer:

• Start -DNA: prøvestoff som skal replikeres.
• Grunnleggende DNA -byggesteiner: Dette er nukleobasene adenin, tymin, cytosin og guanin.
• DNA-polymerase: Et enzym som forbinder individuelle DNA-byggeklosser for å danne en veldefinert DNA-streng. Den nylig oppnådde strengen er et speilvendt (komplementært) bilde av det opprinnelige utgangsmaterialet.
• Bufferløsning: Polymerasekjedereaksjonen finner sted i en fysiologisk bufferløsning. Dette sikrer forhold som ligner dem som finnes i menneskelige celler. Denne løsningen holder pH stabil og inneholder også magnesiumioner. Disse kontrollerte forholdene er nødvendige for å sikre funksjonaliteten til DNA -polymerasen.
• Primere: De består av 16 til 24 basepar og fungerer som startposisjon og startsignal. Primere viser DNA -polymerasen på hvilket tidspunkt (av start -DNA) kopieringsprosessen begynner.

Hvordan utføres en PCR -test?

Siden alle stoffene som kreves for en PCR nå er i reaksjonskaret, kan selve kopieringsprosessen av det genetiske materialet begynne. Dette startes, kontrolleres og stoppes igjen av temperaturen.

Reaksjonsbeholderen blir følgelig oppvarmet eller avkjølt på en målrettet måte til forskjellige temperaturer. Dette gjøres med en spesiell enhet - den såkalte termiske syklisten. Den totale reaksjonen tar omtrent en til to timer.

De enkelte trinnene i en PCR -syklus er:

• Denaturering av DNA -dobbeltstrengene: Prøven varmes opp til rundt 90 grader Celsius. Som et resultat brytes den originale DNA -dobbeltstrengen i to separate (komplementære) enkelttråder.
• Festing av primeren: Temperaturen senkes til litt under 60 grader Celsius. Som et resultat festes primerne (fremover primere, revers primere) til definerte posisjoner på de tilsvarende enkeltstrengene av DNA.
• Forlengelse: Temperaturen økes til litt over 70 grader Celsius. DNA -polymerasen begynner nå arbeidet med denne temperaturoptimalen. Den festes til primerposisjonene og strekker den opprinnelige enkeltstrengen av DNA trinn for trinn til en eksakt (komplementær) kopi er tilgjengelig (DNA -syntese).

Etter en fullført syklus økes temperaturen igjen til rundt 90 grader Celsius - syklusen starter på nytt.

Ved hjelp av PCR -metoden kan DNA -sekvenser replikeres opptil opptil tre kilobasepar (kbp). Dette tilsvarer rundt 3000 grunnleggende DNA -byggeklosser knyttet til en "kjede". Til sammenligning: det menneskelige genomet lagrer tegningene og informasjonen for cellens drift i rundt tre milliarder basepar - koronavirusgenomet består derimot av 30 000 basepar. En PCR -test kan bare brukes til å reprodusere og undersøke korte deler av det totale DNA.

Primerne er avgjørende

Valget av primere er avgjørende for PCR -prosessen. I Sars-CoV-2 diagnostikk brukes for eksempel flere primere (multiplex PCR).

Corona PCR -tester ser etter tre forskjellige virusgener: Den generelle spesifisiteten øker til nesten 99,99%. Dette betyr at med denne høye trefffrekvensen er det bare én falsk positiv test per 10 000 undersøkelser (hvis prøven er tatt riktig).

Hvor mye kopiert genetisk materiale er det nå?

La oss anta at etter den første syklusen er det to identiske DNA -doble tråder.

Etter hver syklus dobles mengden (kopiert) genetisk materiale. Så mengden DNA vokser eksponensielt.

Med andre ord: etter den andre syklusen er det fire identiske doble tråder - etter den tredje syklusen åtte doble tråder - etter den fjerde syklusen 16 doble tråder og etter den femte syklusen allerede 32 doble tråder.

Medisinske fagfolk gjentar vanligvis denne prosessen rundt tjue til tretti ganger.

Metaforisk sett betyr dette: Selv om bare en enkelt DNA -dobbeltstreng ble funnet i prøven i begynnelsen, vil det etter tjue sykluser allerede være en million identiske kopier i reaksjonskaret.

Hva betyr Ct -verdien?

Antall fullførte PCR-sykluser er gitt i form av den såkalte Ct-verdien. "Ct" er avledet fra det engelske uttrykket "syklusterskel". Denne Ct -verdien gjør det mulig å komme med uttalelser om mengden genetisk materiale som søkes.

Ved en lav Ct -verdi på 20 er det mye genetisk materiale som starter. Men hvis Ct -verdien er høy - rundt 30 sykluser - er det tilsvarende lite DNA. PCR -syklusen må derfor kjøres gjennom oftere.

Trinn 2: Elektroforese "Sortering etter størrelse"

Til slutt, hvis det er tilstrekkelig "beriket" genetisk materiale, kan det som kalles elektroforese finne sted. Forskere bruker en bestemt egenskap ved DNA: dens elektriske ladning.

De individuelle DNA-byggeklossene er knyttet til hverandre via en (negativt) ladet sukker-fosfat-ryggrad. Jo lengre en viss DNA -sekvens er, desto høyere er den elektriske ladningen.

Hvis det genetiske materialet plasseres i et bestemt bærermedium (agarose) og en elektrisk spenning tilføres, begynner DNA -segmentene å bevege seg på grunn av ladningen. Siden en lengre DNA -strekning beveger seg raskere enn et kortere fragment, skiller de seg etter størrelse.

På denne måten kan arvematerialet undersøkes og karakteriseres. I praksis blir en ukjent prøve med en kjent referanse vanligvis brukt på en "startlinje" og sammenlignet med hverandre etter en viss tidsperiode.

Hvis "migreringshastigheten" er den samme for begge sekvensene, betyr dette: Deteksjonen er svært sannsynlig positiv - genet du leter etter er inneholdt i prøven.

Spesialtilfelle for koronavirus: prøveforberedelse og RT-PCR

Patogen-deteksjonen for koronaviruset er et spesielt tilfelle. Sars-CoV-2 er et av de såkalte RNA-virusene. Dette betyr at Sars-CoV-2-genomet er i form av RNA (ribonukleinsyre).

RNA skiller seg bare fra DNA på noen få måter. Blant annet er den tilgjengelig som en enkelt tråd og er basert på sukkerribosen i stedet for 2 "deoksyribose. Nukleobasen tymin har også blitt erstattet av uracil som den fjerde basen.

Dette virale RNA må "transkriberes" til DNA før en vanlig PCR -test. Denne prosessen kalles revers transkripsjon (RT) - derav begrepet RT -PCR. I løpet av denne prosessen oppnås en enkelt cDNA -streng ("komplementært DNA"). I et ytterligere trinn blir den eneste cDNA-strengen supplert med en andre, speilvendt DNA-streng.

På slutten av prøvepreparatet er det en DNA -dobbeltstreng som tilsvarer den opprinnelige planen for virus -RNA: Bare denne dobbeltstrengen kan nå brukes som en mal i en PCR -test.

Hvor lang tid tar det å få resultatet?

Etter å ha sendt prøven til laboratoriet, vil du vanligvis motta et resultat etter en eller to virkedager.I testsentre, som ofte undersøker prøvene på stedet, kan dette bare ta noen timer. Tidsperioden avhenger i stor grad av det respektive testsenteret og dets logistikk.

Til tross for de komplekse arbeidsprosessene, kan moderne laboratorier utføre PCR -tester med høy gjennomstrømning. Spesielle automatiserte enheter hjelper med implementeringen.

PCR -testen anses fremdeles å være en relativt "treg", men desto mer pålitelig deteksjonsmetode.

Hva skjer hvis resultatet er positivt?

Hvis prøven er tatt riktig, betyr en positiv PCR-test at personen som testes er svært sannsynlig å bli smittet med Sars-CoV-2.

Hvis du har blitt bekreftet å være smittet med koronaviruset ved hjelp av en PCR -test, vil helsedepartementet motta en melding fra det respektive laboratoriet om det positive testresultatet. I et slikt tilfelle vil helseavdelingen beordre isolasjon eller karantene.

Blir jeg automatisk smittsom hvis jeg får en positiv PCR -test?

Mesteparten av tiden ja. Men ikke alltid. Et resultat av en PCR -test bør alltid tolkes i kontekst. En positiv test betyr først og fremst at du har viralt materiale i deg.

Hvis du nylig har lidd av Covid 19 (noen dager), kan en PCR -test fortsatt være positiv - selv om du allerede er frisk igjen. Dette er et spesielt tilfelle og baksiden av en svært sensitiv test, da den også kan oppdage fragmenter av et virus som ikke kan reprodusere.

En supplerende antistofftest er noen ganger nyttig

I slike tilfeller gir en antistofftest sikkerhet som sikrer validiteten til PCR -testen. Det er best å diskutere dette med legen din. De kan hjelpe deg med å tolke et PCR -testresultat riktig.

Hva skal jeg gjøre hvis resultatet er negativt?

Et negativt PCR-testresultat betyr med stor sannsynlighet at du ikke fikk Covid-19 da prøven ble tatt og derfor ikke er smittsom for tiden. Imidlertid kan du være i de tidlige stadiene av infeksjonen.

Vanligvis kan koronainfeksjoner bare oppdages fra den andre eller tredje dagen etter infeksjon. Så resultatet er ikke en gratis billett. Du bør derfor fortsette å følge avstands- og hygienereglene og fortsette å bruke en FFP2 -maske - for deg selv og for å beskytte andre.

PCR -test hos barn

En pediatrisk PCR -test er ikke forskjellig fra en voksen PCR -test. Både prøvetaking og tolkning av resultatene gjelder både barn og voksne.

Hva er risikoen ved en PCR -test?

En PCR -test utgjør ingen fysiske farer. Bare prøvetaking av nasopharyngeal vattpinne oppfattes som irriterende eller ubehagelig av noen mennesker.

Hva koster en PCR -test?

Eventuelle kostnader som påløper for en PCR -test dekkes hvis legene dine eller helseavdelingen godkjenner en slik test. Refusjon av kostnader vurderes vanligvis hvis du allerede har dine egne symptomer eller hvis du har hatt direkte kontakt med infiserte personer.

Selv i tilfelle en positiv hurtig- eller selvtest, har du rett til en gratis PCR-test.

Vær oppmerksom på: Hvis du har testet deg selv hjemme og fått et positivt resultat, bør du avtale en avtale med fastlegen din umiddelbart på telefon. Din behandlende lege vil diskutere den videre prosedyren med deg på telefon.

Alternativt er det best å ringe 116 117 for å registrere deg for en PCR -test. Frem til bekreftelsestesten bør du helst være hjemme for å beskytte deg selv og andre.

Tags.:  næring alkohol alternativ medisin